激酶会武术，谁也挡不住

前几天看到Nature的文章，说是老鼠的cdk1自己就可以撑过细胞周期。S期的几个激酶——cdk4/cdk6/cdk2都被敲掉了，而cdk1则独当一面，把有丝分裂进行到底。也许现行的哺乳动物细胞周期调控要重写了。

原来利根川進的姓是“利根川”

利根川原来是日本流域面积最广的河流。原以为诺贝尔奖的得主是姓“利根”的呢。圡啦！

楷模啊！学生物当如是！

发信人: crystaler (民工), 信区: Biology
标 题: 忏悔录--大概做生物的PHD 我算是最轻松的了
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Jun 7 06:02:29 2007)

看到板上的兄弟姐妹们那么辛苦 先BS一下自己

因为老板巨nice 我一般上午都是睡眠中度过的 中午和朋友出去找饭馆吃饭1-2个小时不等回到实验室后花至少一个小时时间浏览文学城和买卖提 看的头晕眼花就去喝午后茶抽午后烟 回来开始工作 2-3小时 大部分都是装样子 然后就去健身房了 两个小时候回家做饭吃饭 晚上或者看电视 找朋友玩 发呆 聊天等等 或者去实验室工作2-3小时（各占50%）

周末不是吃饭喝酒就是打牌 偶尔去酒吧club（除非当时有工作任务 我比较想尽早做完）篮球足球跆拳道 全年都有各种比赛 美国除了阿拉斯加 想玩的地方也基本都去了 中间回了4次国 除了一次是公费开会（大部分时间其实都去K歌、喝酒、三里屯了） 其余都在5周以上

我的工作分两部分 一半需要做bench 一年估计做个5-10次吧 每次搞个几天 这几天算是辛苦的 都要超过8小时的工作量 虽然不是连续工作另一半是数据处理 刚入行的时候一套数据要搞小半年 现在熟了 一次连续5小时工作一周之内肯定搞定了 有个2-4套数据就可以出一个paper了

读paper这种事情 自从发现了（白天读paper打瞌睡 晚上读paper睡得香）这个定理就再也不看了（除非要写东西 或者确实和我的课题比较相关的文章还多半是老板发给我的）如今 一作发了一篇biochemistry 刚投了一篇JACS（老板说这么大的数据量肯定会接收的 虽然我也不sure）合作的发了一篇 还有两篇二作 板上钉钉的 基本工作都完成了 前几年期间还有莫名其妙的以前在国内当小本的时候被挂名的文章出来 而且是我所有文章里面IF最高的 （一篇是nature） 汗一个

最BS自己的是 没有一篇是我写的 我们实验室写作工作都是老板搞 丫文笔巨好 我只管着写实验部分（拿着以前的稍微改动一下） 和做图（这个还多少有点工作量）写完了给我proofreading 我也懒得看 有空看好了 老板说早就投了 就是写过qualify
proposal， 还被老板改得面目全非（不过丫直接在word文档改的 我把他highlight的部分格式改过来就好了） 这次给我改thesis （由我发的文章内容拼凑而出 所以基本上就是开头和结尾要写）因为他是打印出来在飞机上改的 给我的时候还不好意思 怕我看不懂他的笔记

我们实验室人少 而且女性之间都有矛盾 所以开了两次不成功的lab meeting之后 老板再也不开了 而且我还属于两个系联合培养 说实在 就是两个系哪里有吃的玩的活动 我就去 哪里有麻烦事情 我就不去 反正都有借口本来可以四年毕业的（那时候已经有一篇一作了 符合毕业标准了） 但是老板一度假前后就去了一年 每两个月回来一趟 我实在没法提毕业 （说来就来气 丫一般都是每年只度两个月假期的 居然在我四年这么关键的档口上发疯 走了一年） 一折腾 拖到5年上（中间我回国探亲被check 搞了两个多月 后来又因为H1B用光了 为了留个OPT的后路又拖了一下）

论文写完了 下个月答辩 committee不是老板的哥们就是不懂我做的这个具体方向的PHD就要到手了 发现5年就搞明白一个问题 自己不喜欢也不适合（性格上）搞科研 再BS一下自己 按照一个兄弟的话说 虽然拿的两万多块钱不算多 要是算一下真正工作量
的话 其实也不比律师少

实验室的日子估计到头了 发个小文 算是个了结吧 将来的日子 该死鸟朝上 要慢慢闯了

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注意：GFP的不一定

GFP虽然可以荧光，但是其激发、发射波长却不一定。主要是因为一些突变，造成的波长移动。

Wild type GFP from jellyfish has two excitation peaks, a major one at 395 nm and a minor one at 475 nm with extinction coefficient of 30,000 and 7,000 M-1 cm-1, respectively. Its emission peak is at 509 nm in the lower green portion of the visible spectrum. The GFP from the sea pansy exhibits a single major excitation peak at 498 nm. Crystals of GFP exhibits a nearly identical fluorescence spectrum and lifetime to that for GFP in aqueous solution.

For wild type GFP, exciting the protein at 395 nm leads to rapid quenching of the fluorescence with an increase in the 475 nm excitation band. This photoisomerization effect is prominent with irradiation of GFP by UV light. In a wide range of pH, increasing pH leads to a reduction in fluorescence by 395 nm excitation and an increased sensitivity to 475 nm excitation.

Some mutants of the GFP gene have been produced which have increased fluorescence. The major excitation peak has been red-shifted to 490 nm with the emission staying at 509 nm. This is better for use with standard optical filter sets, as the mutant GFPs have excitation range more compatible with the commonly available optical filters. This also is more useful for confocal laser scanning applications. The corrected excitation and emission spectra of GFP and some of its variants (termed as BlueFP, CyanFP, GreenFP and YellowFP variants) are shown here:

关于blast2

使用blast时，一定要检查输出目录的写权限。直接拷贝、untar的目录很可能没有写入权限，却不一定会怀疑到。保险的办法还是chmod -R 755 ./*，不管3721，先能用再说。BTW, 出错的输出是：

[blastall] FATAL ERROR: BlastFormattingInfoNew returned non-zero status

连夜看细胞啊

分子细胞生物学，还有H Yu的论文。似乎H的论文和他以前的某些考题范围还是暗合的。不知道这样押宝是否有意义。

复习有的时候真的像是练功，偶尔也会偷点小懒，悟天和特兰克斯合体时不还在时间和精神的房子里面偷懒么？

费解了

老板的讲义上有关p21等对于CDK们作用的叙述，说“p21他们居然paradoxically正调控了cdk-4,-6”。可是这和教科书上的说法矛盾！考试时到底follow谁的呢？

另一个问题在于14-3-3到底跟cyclin-b啥关系。有待弄明白啊！

准备Presentation还真是折腾人啊。整个下午就没干别的。

传说中ANOVA最难做到的

就是同组样本据之间独立。

好的统计学家说

你只有三个数据, 然后问一个统计学家 :证明这些数据是正态分布的.
好的统计学家不会给你证明,而是会说: 你给我证明它不是正态的.

今晚

窗外警铃大作，
无他，
做实验。

动物房的味道很大

绕过一幢楼都能闻见。

啥叫成熟的实验室？

啥叫成熟的实验室？成熟的实验室的标志就是，要有榔头。即使你的实验室再老，再旧再缺经费，如果让人看到你的实验室里居然还有榔头这样齐全的设施，那么别人当然就会相信你的实验室的专业水准。即便在又老又旧又缺经费的条件下还能备齐榔头这样的设施，那真是多么的专业啊！榔头，一件终极的有用装备，无论是你需要敲下冰箱上的碎冰，还是对离心机进行末日审判或者郁闷的参与针对隔壁的集体pk，对你来说都是不可或缺的。所以，你的实验室最最重要的东西是——榔头。

看来不能偷懒啊

做个midiprep，以为不会有问题，就没留中间几步的sample，结果得到的全都是linear的plasmid，还要从头再来。FT!

看来问题总会出在以为不会出现问题的地方。
BTW，我还是没弄清楚QIAGEN到底怎么读。

Seminar: Leukocyte recruitment to the glomerulus

今天听了来自澳洲(MONASH)的Michael Kuligowski的presentation，讲的是白细胞（确切地说是（嗜）中性粒细胞）在肾小球发生炎症时是如何recruit的。他的研究主要集中在P-selectin的作用上。最后结论是，neutrophil不是直接在肾小球中急速流动的血流中rolling的。嗜中性粒细胞想要在内皮细胞上rolling，需要血小板的p-selectin。实验中用到了数种gene KO鼠，不过讲的比较快，没记住。另外还用了射线杀死骨髓造血干细胞，然后移植血小板，这点儿没太看明白——他们怎么排除其他血细胞的作用的呢？

Plos's interesting symbol

Is this the reason why more than two guys sharing the credit is generally not accepted?

到底Mantoux Test能不能测出是否接种过BCG呢？

也许俺的Mantoux Test皮试是白做了。中国的医疗纪录就是成问题啊。大家为了报销，用过的姓名就都是一箩筐。追查小时候生病时的处方和接种过的疫苗就更是Mission Impossible了。

至于这个问题，还是那个包治百病的理由——个体差异。

http://www.moh.govt.nz/moh.nsf/0/4760DF3580A6F5B5CC256C86006ED394/$File/2.Mantouxtesting.pdf
The effect of BCG vaccination on tuberculin reactivity

• The level of reactivity in a vaccinated person is variable, ranging between 0 and 15 mm. Reversion can occur (eg, the reaction wanes with time).
  

• A Mantoux reaction of > 15 mm induration should not be attributed to BCG vaccination.

• There is no relationship between the post-vaccination Mantoux result and protection against TB disease. Routine post-BCG vaccination tuberculin testing serves no purpose

Dr.Yu Zhao @NKU.EDU.CN

笑话：争钥匙

按，在中科院听到这则轶事，隐诸君姓名，唯博看官一笑。
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alpha, beta两场答辩，都需要同一间屋子做作会场。
alpha场的老师A事先贴条，并同管钥匙的人约好，不见本人不给钥匙。由于预见到beta场的老师B习惯晚来，就没特别早去。结果B提前来抢钥匙，管钥匙的告知，“A已贴条”，B强调，“俺没见着”。几经争执，最后B告诉管钥匙的人：“已经同A协商，A同意使用。”结果，B拿到钥匙，旋即招呼学生，“汝等欲答辩否？速速准备停当！”少顷，本本连上投影仪，A至，郁闷至极。

转载：K.Mullis 和 PCR的故事

我们从这里可以得知：在某个年代的美国，实验室里可以狎妓，嬉皮士可以拿学位，《自然》杂质也很水，凡错误越多，成功也就越近，当然假设是正确率一定，而错误多说明尝试次数也很多。

天晓得这家伙是不是找到了自己的内心……
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末代沙皇尼古拉二世、1918年的流行性感冒病毒、电影《侏罗纪公园》，以及辛普森杀妻案，这四件事情到底有什么相关？答案是没有。只不过近十 几年来生物技术的一项新发明，把它们给连在一块了。这项技术就是“聚合酶链反应”（polymerase chain reaction，PCR）。

PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。

PCR的原理及做法其实不难，它利用DNA双链复制的原理，将一条DNA序列不断加以复制，使其数量以几何级数方式增加，就可用来做定性的分析及各式各样 的应用。DNA双螺旋结构于1953年发现，自此确立了它就是细胞里携带遗传信息的分子。第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合酶 （polymerase，即PCR之P），也早在1956年分离成功。几十年来，在试管内复制DNA已是许多实验室的例行工作，但就是没有人想到以PCR 方法大量复制DNA，就算想到也不认为可行，直到1983年。

DNA在复制时，其中两条以氢键结合的互补链必须先行分开，才能各自作为复制的模板；而打开双螺旋的最简单方法就是加热。在高温下，双股DNA链会分离成 单股，等温度降低后，互补的两条DNA链又可以恢复成双股。虽然DNA分子能耐高温，但进行DNA复制所需的聚合酶是蛋白质，在高温下会失去活性。这也是 之前的研究人员不认为这种方法可行的原因之一。再有，要在千万条DNA当中，以一小段已知序列制成的引物，“钓”出所需的片段，进行复制，也跟大海捞针差 不多，这是另一个让人却步的理由。

PCR的发明人，一般公认是穆里斯（K. Mullis），他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。穆里斯在好些写作中，包括1990年在《科学美国人》上的一篇文章，及1998年的自传《心灵 裸舞》（Dancing Naked in the Mind Field），都曾提到PCR这个构想的起源。然而，PCR从构想到实现，真的就是穆里斯一人之功吗？PCR究竟是在什么样的环境下诞生的呢？

穆里斯的出身是生物化学家，1972在加州大学伯克利分校取得博士学位，专长有机合成。一早他就表现出桀骜不驯的性格，在那嬉皮的年代，吸食自制的迷幻药 不算太稀奇，穆里斯也乐于此道。更让人难以想象的是，他在经历迷幻药之旅的过程中，居然想出了某个解释大爆炸宇宙学的理论，写了出来投稿到《自然》周刊， 居然登了出来。他也因此通过了博士资格考，因为有文章发表在《自然》周刊的教授已然不多，学生更是少见。至于他的博士论文，也是用“带点幽默的口语化写 成”（穆里斯自己的说法），要不是宽容的指导老师帮他讲话，只怕要重写。

穆里斯另一个毫不掩饰的爱好是女人，这也给他的生涯带来许多转折。博士学位到手后，他随着新婚的第二任妻子来到堪萨斯州，因妻子的关系进了该州的医学院就 读，他也在那儿的心脏科找到与其学位并不相称的工作。不久他就感到厌恶，因为实验需要宰杀许多老鼠。1975年，他与妻子仳离，又与后来的第三任妻子回到 加州湾区，在第一任妻子所有的一家糕饼店当了近两年的经理。1977年，才又回到旧金山加州大学医学院的药物化学实验室，走的仍然不是学术的正途，也同样 在不久以后，对新工作感到厌烦。

1979年，穆里斯进了湾区一家名叫“西特斯”（Cetus）的私人生物技术公司任职。当年，生物技术公司还处于萌芽阶段，很少学术界人士愿意离开象牙塔 的庇荫到私人企业工作。就算是到有规模的大药厂，同样也得不到多数同行的认可与祝福，认为是学术生涯的终点。然而西特斯却是一个极为特殊的所在，这家公司 集结了一批有能力、有梦想的科学家，在自由开放的风气下，共同朝既定的目标前进。这和一般学院里各大教授及实验室的主持人关起门来各行其是的做法，相当不 同。西特斯聘用穆里斯，是想借重他有机化学合成的专长，负责合成寡核苷酸（短链的DNA分子），以供实验所需。

自1970年代起，由于发现选择性切割及接合DNA分子的限制性内切酶，可将DNA分子加以重组，因此引发了基因工程的开展，才出现生物技术这个产业。于 是，西特斯公司从1970年代以制造维生素及抗生素为主的公司转型，进入1980年代以基因产品为主的研发。生长激素、胰岛素、凝血因子、干扰素、白介素 等，都是西特斯的研发对象。1981年，西特斯正式成为上市公司，筹措到大笔资金。

穆里斯就是在这股氛围下进入西特斯的。其实他做的工作，不算什么研究，只是设法改进寡核苷酸合成的效率而已。穆里斯花了很多时间玩当时刚流行的个人电脑 （还不是IBM的），也经常提出古怪的想法，其中大部分都是错的。他争强好斗、不接受批评的个性，也令他到处结怨。他在工作单位与异性的关系，更惹出许多 麻烦，甚至要劳动主管出面解决。1981年，他升任寡核苷酸合成部门的主管。为了提高产量及节省时间，他省略了品质管理的步骤，引起使用单位的不满，声称 品质不佳的寡核苷酸使得他们的研究出现问题，穆里斯则反击说是使用单位本身的能力不足所致。

PCR的点子，也就是在这样的情况下诞生的。根据穆里斯自己的说法，那是在1983年春天的一个周五晚上，他开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的 乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。穆里斯原以为这样简单的想法，应该有人提出过，但搜索文献后却发现没有。在“顿悟” 之后的三到五个月间，穆里斯并没有任何行动，原因如今也不清楚。该年8月，穆里斯首次在公司里正式作了有关PCR原理的报告，听者反应冷淡。一来，大家已 经习惯了他的胡思乱想；再者，多数人的想法是，这个原理太简单了，如果可行的话，一定早有人做过，否则，里头一定有它不可行之处，但也没有人明确说得出 来，为什么不可行。

于是，穆里斯得着手证明这个构想的可行性。从1983年9月起，穆里斯陆续进行了一些实验，换过几个DNA模板，也尝试不同的加热、降温周期，结果都不够 肯定，顶多只在电泳凝胶上形成一条若有若无的线条，未能说服旁人PCR发挥了增幅的功效。1984年6月，穆里斯在公司又因男女关系惹出事端，引起众怒， 濒临被开除的命运。结果是引荐他进入公司的上司为他说情，只免除了他的主管职务，并予转组，同时限定他在一年内把PCR建立起来。

任何研究方法从概念提出到实际应用之间，所需投入的精力与时间，大多为一般人所低估。由于穆里斯本身没有分子生物学的训练，公司派了技术员协助，前后一共 有三位。这些人在PCR的发展上，发挥了重要的作用。1984年11月，穆里斯的技术员首次取得可信的结果，证明了PCR的可行。于是在1985年初，公 司决定让技术精湛的日裔技术员才木（Randall Saiki）加入工作，这是一项正确的决定。在自动化的仪器出现之前，PCR是个劳动密集型的实验方法，需要长时间的反复操作，手脚不利落的人是做不来 的。才木的结果则干净漂亮，让人无从置疑。

到了1985年春天，西特斯的高级主管已经对PCR的潜力信服，也开始担心消息外泄（穆里斯自己是个大嘴巴），而让旁人取得先机。3月里，他们送出了第一 个专利申请，也准备在10月举行的美国遗传学会年会上报告成果，但之前必须将正式的论文写好投送才保险。他们决定写两篇文章，一篇关于PCR的理论，由穆 里斯执笔先行发表，第二篇则集中在PCR的应用上，以才木的实验结果为主，随后推出。结果整个夏天，穆里斯都在玩电脑，一再拖延论文的写作。到9月下旬另 一篇应用文章写好投送时，穆里斯还没有动静。因此，第一篇提到PCR这个方法的论文，于1985年12月20日发表在《科学》周刊上，共有七位作者，才木 排头名，穆里斯则排第四。

到了该年12月，穆里斯才将论文写好，并投给《自然》周刊。但穆里斯忘了附上一封给编辑的信，当然也就没有说明该文与《科学》周刊上的那篇有何不同，结果 遭到退稿。震惊之余，他转投《科学》周刊，并由西特斯的主管帮助写了封信给编辑，结果仍然遭到退稿。这时，穆里斯把怒气转向公司，认为那是公司的阴谋，想 要窃取他发明PCR的功劳。科学发明的优先权及功劳之争，科学史上可谓不绝于书，也常是公婆都有些道理，不细察背景与经过，只凭后人记载的片言只语，是很 难了解真相的。至于PCR的概念是穆里斯的结晶，没有什么人有异议，只不过将概念实现的过程，就复杂得多了。

穆里斯的文章两度遭退稿后，公司里有人建议投给《酶学方法》（Methods of Enzymology），主要是因为有人与该刊主编吴瑞相熟，较好沟通，同时PCR的性质也适合该强调方法学的刊物。于是，穆里斯的文章终于得到发表，只 不过整整晚了一年，到1987年初才问世。这篇文章只有穆里斯及另一位技术员两人挂名。

为了表示他们并无意争功，西特斯的主管向冷泉港实验室的沃森（DNA双螺旋结构的发现人之一）推荐穆里斯在1986年5月举行的“人类分子生物学”专题研 讨会中，报告PCR的原理及实际应用结果。这是穆里斯生平第一次受邀演讲，分子生物学界有头有脸的人也都在场。结果他表现不错，建立了往后人们的印象： PCR是穆里斯一手发明的。冷泉港专题研讨会的专刊于1986年底出版，还在《酶学方法》的文章之前，穆里斯挂头名。

自此，PCR之名及其强大的应用性就广为人知了。然而，将PCR变成真正成熟技术的临门一脚，则是耐高温DNA聚合酶的引进。

先前提到，PCR的操作过程中，需要反复加热与降温的步骤，而前一次循环所使用的大肠杆菌DNA聚合酶在高温下就变性了，因此在每一次冷热循环之后，都要 加入新鲜的聚合酶。这个做法不但烦琐，并且昂贵。按当时的价格，一次循环所需的聚合酶值1美元，30个循环下来就是30美元，循环更多次就更不得了。因 此，1986年春，穆里斯首度提出使用耐高温酶的想法。经过文献搜寻，果然找到了两篇有关文献，较早的一篇是在美国做的，另一篇则是俄国科学家的成果，以 俄文发表。

第一篇报道分离耐高温DNA聚合酶的工作，是一位来自台湾的年轻科学家初试啼声之作。1973年，钱嘉韵随着留学热潮到俄亥俄州的辛辛那提大学生物系就 读。她的指导老师崔拉（J. Trela)对一种黄石公园的热泉里发现的嗜热菌（Thermus aquaticus）感到好奇，就让钱及另一位美国学生以该细菌为论文研究的主题。在另一位老师的指导下，钱学会了从细胞中分离蛋白质，成功分离出该细菌 耐高温的Taq DNA聚合酶。

1975年获硕士学位后，钱转往衣阿华州立大学取得神经生物学博士学位，1982年回到阳明医学院神经科学研究所任教，至今已满20年。那篇历史性作品， 发表于1976年的《细菌学杂志》（Journal of Bacteriology），她是第一作者，只不过用了英文名字Alice，再加上她后来挂了夫姓（Chang），以至没有太多人知道，该篇被广为引用的 文章的作者A. Chien就是钱嘉韵。

穆里斯虽然提出将Taq DNA聚合酶应用到PCR的建议，但当时并没有现成的可用，他得想办法自己分离。西特斯有全套分离蛋白质的装备，也有人愿意指导，但穆里斯是个拖延成性的 人。等了几个月后，公司其他人只有自己动手，按着先前钱等人发表的步骤，三个星期就分离出纯化的Taq DNA聚合酶。1986年6月，才木首度将其应用于PCR，效果就好得惊人，可说是一战成功。Taq DNA聚合酶不但大大简化了PCR工作，同时专一性及活性都比之前使用的酶更强，背景杂讯也几乎都消除了。自此，PCR取得了完全的成功。

穆里斯与西特斯的关系此后更加恶化，他完全不认为自己在发表文章的过程中有任何疏失，并要求未来五年内有关PCR发表的文章，都由他挂头名。他还在公开场 合批评公司其他人士。终于，穆里斯于1986年9月离开了西特斯。西特斯给了他五个月的薪水及一万美元奖金，但按产业惯例，PCR的专利权属于西特斯公 司。

离开西特斯后，穆里斯继续担任过一些生物技术公司的顾问，但再没有发表过一篇正式论文。以他的说法，PCR就是他一人发明的，得了诺贝尔奖的肯定后，也更 听不到太多其他的声音。1991年12月，霍夫曼罗氏药厂据称以三亿美元购得了西特斯的PCR技术专利，西特斯公司也走进了历史。直到最近几年，由于之前 钱嘉韵等人已经发表的工作，Taq DNA聚合酶的专利权遭到挑战，连带使PCR的专利也受到影响，不过那又是另外一个故事了。

（本文转载自台北《科学月刊》2002年9月号，作者潘震泽任教于台北阳明大学生理所。）